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PCR擴增試劑盒適合操作的溫度范圍

瀏覽次數:851發(fā)布日期:2022-04-24
  PCR擴增試劑盒可在標準的37℃-42℃的溫度范圍內操作。過高的溫度會對反應體系產生不利的影響,因為酶會逐漸地失去全部活性。對于RT試劑盒,我們建議客戶在40℃下運行反應,因為逆轉錄酶在稍高溫度下具有更高的活性。
  PCR擴增試劑盒是指在PCR擴增反應體系中加入熒光基團,通過對擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時檢測,通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
  以探針法熒光定量PCR為例:PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。開始時,探針完整地結合在DNA任意一條單鏈上,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收,檢測不到熒光信號;PCR擴增時,Taq酶將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。
  傳統(tǒng)的PCR進行檢測時,擴增反應后需要進行染色處理及電泳分離,并且只能作定性分析,不能準確定量,易造成污染出現(xiàn)假陽性,使其應用受到限制。實時定量PCR技術不僅實現(xiàn)了對模板的定量,且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好、自動化程度高和無污染的特點,使得熒光定量PCR逐漸取代常規(guī)PCR。
  在PCR擴增反應的數個循環(huán)里,熒光信號變化不大,接近一條直線,這樣的直線即是基線,這條線是可以自動生成也可以手動設置的。之后反應會進入指數增長期,這個期間擴增曲線具有高度重復性,在該期間,可設定一條熒光閾值線,它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上,但一般會將熒光閾值的缺省設置是 3-15 個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10 倍。每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環(huán)數被稱為CT值,這個值與起始濃度的對數成線性關系,且該值具有重現(xiàn)性。
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